La source de la Mayenne est identifiée au petit ruisselet qui sort dans la commune de Lalacelle dans l'Orne, à 300 m. d'altitude, au sud du plateau qui porte le bourg de Ciral. Ses eaux pénètrent dans le département de la Mayenne entre Saint-Samson et Pré-en-Pail, traversent Saint-Calais-du-Désert, Couptrain, et Neuilly-le-Vendin, puis forment la limite entre la Mayenne et l'Orne de Madré (limite avec Saint-Ouen-le-Brisoult) jusqu'à Melleray-la-Vallée (limite avec Loré). Dans cette première section, elles s'écoulent faiblement d'est en ouest, dans une vallée large et plane. A partir de Cigné, la rivière change d'orientation et de profil. Orientée nord-sud, elle s'enfonce dans le plateau et adopte une forte pente. Son profil transversal en V est cependant plus ou moins accentué selon qu'elle traverse des roches dures (granite et schiste surtout, grès plus rarement) ou tendres (calcaire). Elle traverse le département de la Mayenne de part en part et pénètre après Daon dans celui du Maine-et-Loire. Au nord d'Angers, elle reçoit les eaux de la Sarthe et du Loir pour former la Maine qui se jette dans la Loire au sud de la capitale de l'Anjou.

L'aire de drainage de la Mayenne est assez étroite. Ses affluents principaux sont, sur la rive droite, la Varenne, la Colmont, l'Anxure, l'Ernée, le Vicoin et l'Oudon et sur la rive gauche, l'Aisne, l'Aron, la Jouanne et l'Ouette.

Les trois principales villes du département, Mayenne, Laval et Château-Gontier, se sont installées sur son cours. Elles se sont développées au haut Moyen Age à proximité de forteresses destinées à protéger des points de passage. Toutefois, l'encaissement de la rivière explique que la plupart des villages se soient implantés à l'écart, sur le plateau. De franchissement longtemps difficile, la Mayenne n'a pourtant pas constitué une frontière, sauf au IXe siècle, lors de l'apogée de la puissance bretonne.